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[求助]
簡(jiǎn)并引物PCR求助 已有1人參與
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剛剛跑完膠，結(jié)果很不好，只能來(lái)求助了。 用設(shè)計(jì)了幾對(duì)簡(jiǎn)并引物，開(kāi)始用降落PCR沒(méi)有產(chǎn)物，后來(lái)就把退火溫度降到46度，加4%DMSO,增加鎂離子濃度至1.2mM，第一對(duì)引物出現(xiàn)了400-2000附近多條雜帶(預(yù)期1000bp)，如圖1，marker旁邊是空白，居然也有亮帶。。。 嘗試用第2~4對(duì)引物(在第一對(duì)之內(nèi))進(jìn)行巢式PCR，結(jié)果沒(méi)條帶，還出現(xiàn)了從點(diǎn)樣孔到前沿的亮帶，如圖2，全部都是亮帶。。。  我這樣用巢式PCR對(duì)不對(duì)呢，新手入門(mén)，求指點(diǎn)問(wèn)題所在，以及后續(xù)辦法。 2 .jpg 1 .jpg |
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木蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
小蟲(chóng)
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
Ivy塵: 金幣+12 2015-02-03 10:34:59
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
Ivy塵: 金幣+12 2015-02-03 10:34:59
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既然巢式PCR之后出現(xiàn)了拖帶而且跑的那么。。。說(shuō)明方法不對(duì)啊。看你這兩張圖，完全沒(méi)跑出結(jié)果啊。。。。 設(shè)計(jì)好引物之后，正常PCR啊，為什么一開(kāi)始就要用降落PCR呢？進(jìn)行各試劑濃度，溫度的摸索是正確的，但應(yīng)該在一兩次PCR沒(méi)有結(jié)果的時(shí)候再?lài)L試啊。從marker來(lái)看，膠的質(zhì)量（濃度）也有問(wèn)題，原因應(yīng)該從各方面分析 模板：模板是什么，多少bp，反應(yīng)終濃度多少呢？ 引物：兩張圖都說(shuō)明了，引物要不就沒(méi)問(wèn)題，要不就是有大問(wèn)題，特異性太差，完全沒(méi)條帶，都是拖尾 擴(kuò)增試劑：擴(kuò)增的酶（保真酶，熱啟動(dòng)酶熱啟動(dòng)酶，普通酶）鎂離子 DMSO 可以使用專(zhuān)門(mén)的不用額外加進(jìn)去的buffer，這樣就省略了對(duì)這兩者還要進(jìn)行濃度優(yōu)化。還有反應(yīng)條件（溫度，時(shí)間） 個(gè)人認(rèn)為全部都要再考慮一遍 好運(yùn) |
4樓2015-02-03 09:29:17
2樓2015-02-03 00:15:54
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5樓2015-02-03 09:32:03
6樓2015-02-03 10:26:57
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