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小_菜鳥(niǎo)新蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
western blot出現(xiàn)很多雜帶，求助，交流？謝謝 已有2人參與
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SDS-PAGE有三條帶，western blot剛開(kāi)始用5%脫脂奶粉封閉2h； 一抗HIS 1:1000，2h；二抗羊抗兔1:5000，2h；洗滌用TBST 5X5min，出現(xiàn)超多的雜帶，降低一抗（1:3000）、二抗（1:10000）的濃度后從一束的雜帶到只剩三條雜帶，而且大小偏大，目的蛋白加上his應(yīng)該在20KDa左右，但現(xiàn)在出現(xiàn)的三條都是偏大的，有沒(méi)有戰(zhàn)友做過(guò)��？改怎么去調(diào)整比較好呢？謝謝啦（表達(dá)載體是pET28a+） SDS-PAGE.jpg 很多雜帶.jpg 連對(duì)照都出現(xiàn)了.jpg 這是調(diào)整抗體濃度后的.jpg |
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5樓2015-06-19 16:05:01
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【答案】應(yīng)助回帖
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小_菜鳥(niǎo)(西門(mén)吹雪170代發(fā)): 金幣+4, 鼓勵(lì)回帖交流 2015-06-19 20:44:39
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我個(gè)人認(rèn)為可能是： 一。SDS PAGE電泳出的問(wèn)題： 1.SDS電泳時(shí)，樣品上樣前處理不好，可能SDS的量不夠，平均1克蛋白質(zhì)結(jié)合1.4克SDS，實(shí)際操作時(shí)SDS還應(yīng)該多一些。 2.電泳時(shí)間可能沒(méi)有掌握好。 3.可能是SDS電泳的“鬼帶”“出現(xiàn)了。 鬼帶”就是在跑大分子構(gòu)象復(fù)雜的蛋白質(zhì)分子時(shí)， 常會(huì)出現(xiàn)在泳道頂端 （有時(shí)在濃縮膠中）的一些大分子未知條帶或加樣孔底部有沉淀， 主要由于還原劑在加熱的過(guò)程中被氧化而失去活性，致使原來(lái)被解離的蛋白質(zhì)分子重新折疊結(jié)合和亞基重新締合，聚合成大分子，其分子量要比目標(biāo)條帶大，有時(shí)不能進(jìn)入分離膠。但它卻于目標(biāo)條帶有相同的免疫學(xué)活性，在 WB反應(yīng)中可見(jiàn)其能與目標(biāo)條帶對(duì)應(yīng)的抗體作用。 處理辦法：在加熱煮沸后，再添加適量的 DTT 或 Beta 巰基乙醇，以補(bǔ)充不足的還原劑；或可加適量 EDTA 來(lái)阻止還原劑的氧化。 有關(guān)SDS電泳的各種異常情況可以參考： SDS-PAGE 電泳問(wèn)題討論（實(shí)例版）-----凌波麗個(gè)人總結(jié)之四 http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=7324819 二、抗體-抗原相互作用出的問(wèn)題： 另外，就是樓主的抗體的原因了。 很可能一抗的專(zhuān)一性不夠，或者用量還是大了。 或者二抗的專(zhuān)一性不夠。 |
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小_菜鳥(niǎo)3樓2015-06-19 11:32:42
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4樓2015-06-19 15:01:20
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