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western blot出現(xiàn)很多雜帶，求助，交流？謝謝 已有2人參與
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SDS-PAGE有三條帶，western blot剛開始用5%脫脂奶粉封閉2h； 一抗HIS 1:1000，2h；二抗羊抗兔1:5000，2h；洗滌用TBST 5X5min，出現(xiàn)超多的雜帶，降低一抗（1:3000）、二抗（1:10000）的濃度后從一束的雜帶到只剩三條雜帶，而且大小偏大，目的蛋白加上his應該在20KDa左右，但現(xiàn)在出現(xiàn)的三條都是偏大的，有沒有戰(zhàn)友做過��？改怎么去調整比較好呢？謝謝啦（表達載體是pET28a+） SDS-PAGE.jpg 很多雜帶.jpg 連對照都出現(xiàn)了.jpg 這是調整抗體濃度后的.jpg |
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calorimetry
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【答案】應助回帖
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感謝參與，應助指數(shù) +1
小_菜鳥(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+4, 鼓勵回帖交流 2015-06-19 20:44:39
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我個人認為可能是： 一。SDS PAGE電泳出的問題： 1.SDS電泳時，樣品上樣前處理不好，可能SDS的量不夠，平均1克蛋白質結合1.4克SDS，實際操作時SDS還應該多一些。 2.電泳時間可能沒有掌握好。 3.可能是SDS電泳的“鬼帶”“出現(xiàn)了。 鬼帶”就是在跑大分子構象復雜的蛋白質分子時， 常會出現(xiàn)在泳道頂端 （有時在濃縮膠中）的一些大分子未知條帶或加樣孔底部有沉淀， 主要由于還原劑在加熱的過程中被氧化而失去活性，致使原來被解離的蛋白質分子重新折疊結合和亞基重新締合，聚合成大分子，其分子量要比目標條帶大，有時不能進入分離膠。但它卻于目標條帶有相同的免疫學活性，在 WB反應中可見其能與目標條帶對應的抗體作用。 處理辦法：在加熱煮沸后，再添加適量的 DTT 或 Beta 巰基乙醇，以補充不足的還原劑；或可加適量 EDTA 來阻止還原劑的氧化。 有關SDS電泳的各種異常情況可以參考： SDS-PAGE 電泳問題討論（實例版）-----凌波麗個人總結之四 http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=7324819 二、抗體-抗原相互作用出的問題： 另外，就是樓主的抗體的原因了。 很可能一抗的專一性不夠，或者用量還是大了。 或者二抗的專一性不夠。 |
» 本帖已獲得的紅花（最新10朵）
小_菜鳥3樓2015-06-19 11:32:42
4樓2015-06-19 15:01:20
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