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（木蟲生物專題討論）之核酸提取純化專題貼
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第一章 DNA提取與純化 主題6：酵母總DNA提取 鏈接：http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=908616&fpage=3 解答1：三磷酸腺苷 qiagen的核酸提取試劑盒一向都很好用 價(jià)格也不貴 解答2：aiai3252891 第一種方法，如果你擴(kuò)增的片段不是很長(zhǎng)的話，你可試試將培養(yǎng)的菌放入沸水中煮沸，然后離心。此方法的缺點(diǎn)是容易將總基因組切斷，但是很方便。 二、用酶去細(xì)胞壁，然后用SDS,EDTA,乙醇抽提，這種方法非常經(jīng)典，但是操作比較繁瑣，但是提取的基因組非常純凈，而且條件溫和，不易破壞基因組 主題7：生物活性炭中提取DNA 鏈接：http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=906449&fpage=4 解答1： 三磷酸腺苷 用PBS充分清洗樣品，后高速離心（8000~10000rpm左右）把泥土和細(xì)胞一起離下去，棄上清，這一步是去掉細(xì)胞外的可溶性雜質(zhì)。 用PBS重懸，然后低速離心把泥土離到管底，但不至于把細(xì)胞離下去，這個(gè)轉(zhuǎn)速你就好好摸一下就可以了。離過頭了就重新震蕩混勻，降低轉(zhuǎn)速再試試。然后取上清。 上清里頭就含有細(xì)胞了，這時(shí)候就用經(jīng)典的酚抽提法提DNA了 主題8：請(qǐng)教影響DNA降解的因素 鏈接：http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=310068&fpage=350 解答1：zhyl1984 酶，和DNA反復(fù)凍融 解答2：zw771113 剛提取出來(lái)的DNA用TE 溶解時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)不會(huì)使DNA降解? 不會(huì)，TE是金屬離子鰲合劑，而核酸酶一般需要有金屬離子存在才有活性。所以用TE溶解幾個(gè)小時(shí)DNA都不會(huì)降解。 建議你凍存的時(shí)候分裝保存，用的時(shí)候拿一份。就可以避免反復(fù)凍溶造成 DNA降解。 主題9：DNA電泳圖分析 鏈接：http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=444161&fpage=277 解答1：ldxmhyq 曝光過度了吧。點(diǎn)樣孔中有可能是沒跑出來(lái)的樣品，染色染的不好 解答2：xwluo 點(diǎn)樣孔太亮,可能是蛋白未去得干凈,你用酚、氯仿、異戊醇多抽提幾次就可以了 解答3：michaelwuqingyu 蛋白沒有去干凈，蛋白帶正電荷和核酸結(jié)合，導(dǎo)致ＤＮＡ在膠孔這跑不出去 解答4：phyllislhy 點(diǎn)樣孔里的是蛋白質(zhì)，RNA提的倒是不錯(cuò)建議你用CTAB法試一下，可能蛋白或糖等雜質(zhì)比較多，沒有提出來(lái)。 解答5：vivalk 可能是此生代謝產(chǎn)物較多，建議用經(jīng)典的CTAB用盡量嫩的部位提取 解答6：天外飛天 RNA沒除去,用RNAase消化一下 主題10：電泳圖分析（條帶不清晰） 鏈接：http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=454851&fpage=275 解答1：Doublel 電泳時(shí)電壓過高會(huì)導(dǎo)致電流強(qiáng)度增加，而電流的熱效應(yīng)是和電流的平方成正比的，電流強(qiáng)度過高會(huì)直接導(dǎo)致凝膠發(fā)熱。凝膠發(fā)熱使DNA分子熱運(yùn)動(dòng)加劇，擴(kuò)散速度加快，從而導(dǎo)致條帶不清晰。 解答2：levixzhu 1 由于DNA分子量很大，一般建議用0.5-0.8%膠來(lái)電泳。PCR產(chǎn)物基本上可以根據(jù)分子量來(lái)決定膠濃度，一般用1-1.5%的膠濃度。所以建議，你用兩塊膠分別來(lái)跑DNA和PCR產(chǎn)物。 2 電泳電壓對(duì)band的清晰度和分辨率是由影響的，電壓的大小取決于你用的電泳槽正負(fù)極間的距離，一般是3-5V/cm。電壓過高或過低，對(duì)band的清晰度和分辨率都是有影響的。 3 loading buffer的加量，要取決于你用的是幾乘的loading buffer，如果是6Xloading buffer，loading buffer的量為你點(diǎn)樣量的1/6，那么如果你點(diǎn)樣5-6ul，加1ul loading buffer是可以的。如果用的是10Xloading buffer，loading buffer的量為你點(diǎn)樣量的1/10，即如果你點(diǎn)樣5ul，加0.5ul loading buffer就可以了。但是一般情況下，loading buffer量的多少對(duì)于條帶的清晰與美觀并無(wú)太大關(guān)系。 4 我們lab用的也是BIO-RAD的凝膠成像系統(tǒng)，說實(shí)話，你的條帶是不太清晰。 建議A你用制膠的梳子時(shí)選擇梳子空扁長(zhǎng)的，那么條帶會(huì)好看些。膠濃度也要相應(yīng)調(diào)整。 B因?yàn)槟愕腗ARKER也不大漂亮，建議電壓要優(yōu)化些，電泳時(shí)間要視溴酚蘭位于凝膠2/3位置時(shí)，可以停止電壓。 C 還有你的電泳緩沖液，無(wú)論是TBE或是TAE，建議你換新的來(lái)電泳。一步步排除問題 |
7樓2008-08-15 17:23:50
I．技巧篇
2樓2008-08-15 17:13:35
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