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（木蟲生物專題討論）之核酸提取純化專題貼
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I．技巧篇
2樓2008-08-15 17:13:35
3樓2008-08-15 17:15:07
4樓2008-08-15 17:17:49
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第四章 綜合篇 主題1：核酸抽提（最糟糕篇） 鏈接：http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=346409&fpage=320 發(fā)帖人：badger 主題2：核酸抽提原理 鏈接：http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=696113&fpage=127 發(fā)帖人： 靜水深流106 以下為付費(fèi)下載部分 主題3：核酸提取及常見問題分析 鏈接：http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=158181&fpage=411 發(fā)帖人：BEFOREBEYOND 主題4：DNA和RNA提取常見問題分析對(duì)策 鏈接：http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=253999&fpage=348 發(fā)帖人：czl-ee 主題5：關(guān)于真菌的DNA和RNA提取方法的總結(jié) 鏈接：http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=420752&fpage=293 發(fā)帖人：haixianggao 主題6：核酸提取常見問題分析 鏈接：http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=150148&fpage=275 發(fā)帖人：okaysee 主題7：核酸抽提 鏈接：http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=584493&fpage=196 發(fā)帖人：applepie119 [ Last edited by raindrop8316 on 2008-8-15 at 17:20 ] |
5樓2008-08-15 17:18:59
II．解惑篇
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第一章 DNA提取與純化 主題1：蚌的基因組DNA提取問題（拖尾嚴(yán)重） 鏈接：http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=888918&fpage=14 解答1：xyklmu 拖尾嚴(yán)重一般認(rèn)為是所得的DNA有蛋白的污染，蛋白未抽提完全。 分子量大小小于1萬bps，主要是酚氯仿抽提造成剪切所致。要想獲得大分子量的genomic DNA，可以在蛋白酶K充分消化后，直接用異丙醇沉淀即可，不必經(jīng)過酚氯仿抽提的步驟。這也得看你抽提DNA以后，用于什么目的了。如果僅僅是做pcr之類的，不必酚氯仿抽提。 主題2：DNA上樣緩沖液各組分作用，原理 鏈接：http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=893542&fpage=15 解答1： 三磷酸腺苷 一般loadind buffer中的甘油、蔗糖都是輔助樣品沉降的 因?yàn)闃悠诽p，在緩沖液中容易飄起來 所以需要一些重的東西包裹住，然后沉降下去 解答2：yujie8586 DNA用的6xloading buffer 含有色素溴酚藍(lán)（Bromophenol Blue)、二甲苯腈藍(lán)FF（Xylene Cyanol FF)，可以觀察電泳的進(jìn)行情況。溴酚藍(lán)在瓊脂糖凝膠（0.5% ~ 1.4%）中約與300 bp的雙鏈線狀DNA的遷移速度相同（在0.5×TBE中)，而二甲苯腈藍(lán)FF則與4 kbp的雙鏈線狀DNA的遷移速度相等。溴酚藍(lán)與二甲苯腈藍(lán)FF在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移速率則隨凝膠濃度的改變而不同。還有EDTA 和蔗醣。 解答3：xyklmu EDTA是DNAase的抑制劑，可以避免在電泳過程中DNAase的作用。 主題3：植物標(biāo)本DNA提取，樣品保鮮 鏈接：http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=882330&fpage=19 解答1：xueqiao1868 新鮮的最好,降解少! 怎么才能防止變焉???注意保水 采集時(shí)用冰袋,盡快提取 解答2：wyzl2007 最好的辦法是將植物放入衣袋液氮罐中保存，只有有液氮就行 解答3：glenn_007 我的樣品是采下來新鮮的葉片，用蒸餾水和乙醇擦拭表面清潔后，放入變色硅膠中快速干燥的。提取的效果挺好的。 或者用書壓著效果也可以。 只要表面沒有發(fā)黃，沒有真菌和蟲蛀，提取就沒問題 解答4：xujian568 標(biāo)本DNA的提取確實(shí)比較麻煩的，特別是老的標(biāo)本，時(shí)間長(zhǎng)了有時(shí)候就沒有了，降解了，試試運(yùn)氣了，最好是用試劑盒。 保水的方法一般就是減少葉片的蒸騰，還有增加環(huán)境的濕度。 盡快提取。 解答5：ahhflhz 采集回來放-８０度冰箱保存就行了，沒有超低溫冰箱就放在-２０度冰箱， 采葉片的時(shí)候放在冰盒里或者液氮里就可以了 主題4：酒精浸泡的昆蟲標(biāo)本DNA 提取 鏈接：http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=884772&fpage=19 解答1：bioplant 乙醇具有沉淀DNA的作用，會(huì)不會(huì)提取時(shí)，沉淀的DNA在第一次裂解離心時(shí)丟棄啦。 常規(guī)試劑盒也是用普通試劑，所以有時(shí)自己配制的試劑因?yàn)樾迈r，提取效果更好。 解答2： 三磷酸腺苷 估計(jì)是乙醇沒有揮發(fā)干就拿去提 核酸純化做得很好的公司是QIAGEN，要不你聯(lián)系他們的技術(shù)支持看看有沒有合適的試劑盒 主題5：DNA電泳(在100bp處有很寬，很亮的一堆東西，這是什么啊) 鏈接：http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=901836&fpage=1 解答1：11014612 是RNA 解答2：helenfang 在DNA提取過程中RNA很容易被降解，所以我想下面那些應(yīng)該是降解的RNA碎片吧 解答3：snzydong 破碎的DNA片段 解答4：yelitao1983 我想應(yīng)該是RNA而不是DNA破碎的小片段！本人提過N次植物基因組了！如果提取過程中DNA斷裂的話，應(yīng)該是一長(zhǎng)串彌散的帶，不應(yīng)該只在100bp處有帶！如果你非要弄明白是不是RNA，向提出的基因組DNA中加RNA酶再泡電泳驗(yàn)證一下就可以了！ 解答5：xiaochong0101 （樓主） 證實(shí)應(yīng)該是RNA，因?yàn)榧恿薘NA酶之后明顯減少了 |
6樓2008-08-15 17:21:22
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第一章 DNA提取與純化 主題6：酵母總DNA提取 鏈接：http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=908616&fpage=3 解答1：三磷酸腺苷 qiagen的核酸提取試劑盒一向都很好用 價(jià)格也不貴 解答2：aiai3252891 第一種方法，如果你擴(kuò)增的片段不是很長(zhǎng)的話，你可試試將培養(yǎng)的菌放入沸水中煮沸，然后離心。此方法的缺點(diǎn)是容易將總基因組切斷，但是很方便。 二、用酶去細(xì)胞壁，然后用SDS,EDTA,乙醇抽提，這種方法非常經(jīng)典，但是操作比較繁瑣，但是提取的基因組非常純凈，而且條件溫和，不易破壞基因組 主題7：生物活性炭中提取DNA 鏈接：http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=906449&fpage=4 解答1： 三磷酸腺苷 用PBS充分清洗樣品，后高速離心（8000~10000rpm左右）把泥土和細(xì)胞一起離下去，棄上清，這一步是去掉細(xì)胞外的可溶性雜質(zhì)。 用PBS重懸，然后低速離心把泥土離到管底，但不至于把細(xì)胞離下去，這個(gè)轉(zhuǎn)速你就好好摸一下就可以了。離過頭了就重新震蕩混勻，降低轉(zhuǎn)速再試試。然后取上清。 上清里頭就含有細(xì)胞了，這時(shí)候就用經(jīng)典的酚抽提法提DNA了 主題8：請(qǐng)教影響DNA降解的因素 鏈接：http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=310068&fpage=350 解答1：zhyl1984 酶，和DNA反復(fù)凍融 解答2：zw771113 剛提取出來的DNA用TE 溶解時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)不會(huì)使DNA降解? 不會(huì)，TE是金屬離子鰲合劑，而核酸酶一般需要有金屬離子存在才有活性。所以用TE溶解幾個(gè)小時(shí)DNA都不會(huì)降解。 建議你凍存的時(shí)候分裝保存，用的時(shí)候拿一份。就可以避免反復(fù)凍溶造成 DNA降解。 主題9：DNA電泳圖分析 鏈接：http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=444161&fpage=277 解答1：ldxmhyq 曝光過度了吧。點(diǎn)樣孔中有可能是沒跑出來的樣品，染色染的不好 解答2：xwluo 點(diǎn)樣孔太亮,可能是蛋白未去得干凈,你用酚、氯仿、異戊醇多抽提幾次就可以了 解答3：michaelwuqingyu 蛋白沒有去干凈，蛋白帶正電荷和核酸結(jié)合，導(dǎo)致ＤＮＡ在膠孔這跑不出去 解答4：phyllislhy 點(diǎn)樣孔里的是蛋白質(zhì)，RNA提的倒是不錯(cuò)建議你用CTAB法試一下，可能蛋白或糖等雜質(zhì)比較多，沒有提出來。 解答5：vivalk 可能是此生代謝產(chǎn)物較多，建議用經(jīng)典的CTAB用盡量嫩的部位提取 解答6：天外飛天 RNA沒除去,用RNAase消化一下 主題10：電泳圖分析（條帶不清晰） 鏈接：http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=454851&fpage=275 解答1：Doublel 電泳時(shí)電壓過高會(huì)導(dǎo)致電流強(qiáng)度增加，而電流的熱效應(yīng)是和電流的平方成正比的，電流強(qiáng)度過高會(huì)直接導(dǎo)致凝膠發(fā)熱。凝膠發(fā)熱使DNA分子熱運(yùn)動(dòng)加劇，擴(kuò)散速度加快，從而導(dǎo)致條帶不清晰。 解答2：levixzhu 1 由于DNA分子量很大，一般建議用0.5-0.8%膠來電泳。PCR產(chǎn)物基本上可以根據(jù)分子量來決定膠濃度，一般用1-1.5%的膠濃度。所以建議，你用兩塊膠分別來跑DNA和PCR產(chǎn)物。 2 電泳電壓對(duì)band的清晰度和分辨率是由影響的，電壓的大小取決于你用的電泳槽正負(fù)極間的距離，一般是3-5V/cm。電壓過高或過低，對(duì)band的清晰度和分辨率都是有影響的。 3 loading buffer的加量，要取決于你用的是幾乘的loading buffer，如果是6Xloading buffer，loading buffer的量為你點(diǎn)樣量的1/6，那么如果你點(diǎn)樣5-6ul，加1ul loading buffer是可以的。如果用的是10Xloading buffer，loading buffer的量為你點(diǎn)樣量的1/10，即如果你點(diǎn)樣5ul，加0.5ul loading buffer就可以了。但是一般情況下，loading buffer量的多少對(duì)于條帶的清晰與美觀并無太大關(guān)系。 4 我們lab用的也是BIO-RAD的凝膠成像系統(tǒng)，說實(shí)話，你的條帶是不太清晰。 建議A你用制膠的梳子時(shí)選擇梳子空扁長(zhǎng)的，那么條帶會(huì)好看些。膠濃度也要相應(yīng)調(diào)整。 B因?yàn)槟愕腗ARKER也不大漂亮，建議電壓要優(yōu)化些，電泳時(shí)間要視溴酚蘭位于凝膠2/3位置時(shí)，可以停止電壓。 C 還有你的電泳緩沖液，無論是TBE或是TAE，建議你換新的來電泳。一步步排除問題 |
7樓2008-08-15 17:23:50
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第一章 DNA提取與純化 主題11：土樣中DNA的提取 鏈接：http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=156607&fpage=271 解答1：annpc5 附件1：DNA recovery from soils of diverse composition 附件2：直接從土壤中提取DNA得方法 主題12：提取DNA時(shí)，PVP聚乙烯基吡咯烷酮的作用? 鏈接：http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=479437&fpage=258 解答1：發(fā)如雪 聚乙烯吡咯烷酮 分子式：(C6H9NO)n 一、性質(zhì)： 粉末或水溶液，易溶于水及多種有機(jī)溶劑，具有良好溶解性，生物相溶性，生理惰性，成膜性，膠體保護(hù)能力和與多種有機(jī)、無機(jī)化合物復(fù)合的能力，對(duì)酸、鹽及熱較穩(wěn)定。 二、用途： 在化妝品工業(yè)中作為分散劑、成膜劑、增稠劑、潤(rùn)滑劑及粘合劑，在醫(yī)藥工業(yè)中是藥用合成新輔料之一，可用作片劑、顆粒的粘結(jié)劑、緩釋劑。注射劑的助劑和穩(wěn)定劑、膠囊的助流劑，液體制劑及著色劑的分散劑，酶及熱敏藥物的穩(wěn)定劑，難溶藥物的共沉淀劑，眼藥的延效劑及潤(rùn)滑劑和包衣成膜劑等；在涂料、顏料、塑料樹脂、玻璃纖維、油墨、粘合劑、凈洗劑、攝影膠卷、壓片、電視顯像管、生產(chǎn)藥水、膠布、消毒劑、紙張、紡織印染等方面用 作助劑。 解答2：anlewo7777 PVP可與多種物質(zhì)，特別是含羥基、羧基、氨基及其他含活性氫的化合物或單質(zhì)形成絡(luò)合物，例如，它可與許多毒素、病毒、醫(yī)藥及毒性化學(xué)品形成絡(luò)合物，以減少其毒性和刺激性。 與少數(shù)幾種物質(zhì)（如多元酚）的絡(luò)合力很強(qiáng)，在中性及酸性物質(zhì)中，形成沉淀。這種特性可從溶液和飲料中除去多元酚和花色素氰。但使用不溶性 PVP效果更好。 解答3：分子進(jìn)化 主要是除多酚類物質(zhì) 主題13：桃的DNA提�。ü麅鰳映恋恚� 鏈接：http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=488559&fpage=253 解答1：lyl0807 加NaAc試試 解答2：tiny20022005 先用無CTAB的緩沖液洗滌勻漿能較好去除多糖 解答3：randomqd 把離心的速度調(diào)高些 解答4：hallhowe 離心后去掉異丙醇，再加入乙醇沉淀，再離心。離心要高速，4度 解答5：Doublel 雜質(zhì)應(yīng)該是樹膠類物質(zhì)，桃的果實(shí)中含量很多的。 主題14：請(qǐng)問怎樣去除DNA提取產(chǎn)物中的色素等物質(zhì)？ 鏈接：http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=499180&fpage=250 解答1：cdl007 你提的是DNA，可以用玻璃棒挑出來再溶到另一個(gè)管里 多漂洗幾次，應(yīng)該能去掉很多雜質(zhì) 這個(gè)方法最簡(jiǎn)單而且不用引入新的污染 還可以采用非可溶性PVP（polyvinylpyrrolidone）研磨樣品， PVP能絡(luò)合多酚類物質(zhì)，不但能較徹底防止氧化作用，而且能有效的去除多糖和色素，色素是PCR反應(yīng)中的強(qiáng)抑制劑，一定要除掉 主題15：提取一種微型動(dòng)物DNA 鏈接：http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=538532&fpage=223 解答1：xiaopu_yin 估計(jì)一些常規(guī)的方法你都試過，有沒有想過在溶液中加幾丁質(zhì)酶，消化一部分蟲體壁？ 解答2：glucidum 如果LZ只是需要提取一點(diǎn)點(diǎn)DNA 來做PCR,進(jìn)行系統(tǒng)分析的話.建議試試在解剖鏡下直接用鑷子碾碎蟲體然后加入蛋白酶消化處理。消化處理的溶液即可直接用做PCR,不需要再做沉淀處理等等。 解答3：陳碩真 超聲破碎或高速球磨等機(jī)械方法肯定能夠破碎，用研磨也可以 解答4：dajiahaoma Evaluation of extraction methods for the isolation of dust mites 7種提取方法 （附件下載） |
8樓2008-08-15 17:25:41
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第一章 DNA提取與純化 主題16：植物線粒體DNA的提取 鏈接：http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=569136&fpage=206 無解答 主題17：CTAB法提DNA出現(xiàn)問題（碎末狀沉淀） 鏈接：http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=578068&fpage=195 解答1：guohuayin 我覺得碎末狀沉淀是你沒有去除干凈的蛋白質(zhì)，在苯酚－氯仿重提階段，建議不要為了獲取大量的的DNA而將中間的那層吸出來，那層是蛋白質(zhì)，吸取上清液的時(shí)候，在最后快要吸完的時(shí)候，最好不要繼續(xù)吸出了，防止蛋白質(zhì)污染。建議你用苯酚－氯仿抽提一次，再用氯仿：異戊醇抽提一次。并且用70％的酒精多洗滌幾次，酒精洗滌的作用主要是去除鹽分。最后酒精洗滌完后，一定要晾干后再用適量的雙蒸水溶解或者TE緩沖液溶解。 解答2：沙礫 建議大家在做DNA沉淀的時(shí)候加入1/10體積的3M的醋酸鈉，再加無水乙醇，沉淀效果會(huì)更好 主題18：提取DNA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)三條帶，誰能解釋? 鏈接：http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=584447&fpage=195 解答1：tuotuozw 材料，過程都有可能造成DNA的怪異現(xiàn)象出現(xiàn) 解答2：xuuue 可能是連同RNA一起提了出來，這很正常，你去RNA了嗎？ 解答3：如果泳道沒有明顯彌散現(xiàn)象，而且LZ電泳中出現(xiàn)的3條帶中的2條挨得很進(jìn)，且與第3條距離較遠(yuǎn)的話，那多數(shù)應(yīng)該是xuuue所說的提取樣品中混有RNA，加點(diǎn)RNaseA處理一下就可以了。 主題19：核酸提取求助:幫忙分析下失敗原因在哪? 鏈接：http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=593897&fpage=188 解答1：guohuayin 抽提核酸中我的做法是 首先加入等體積的苯酚：氯仿：異戊醇（體積比25：24：1），輕輕上下顛倒幾次，混勻2分鐘左右，12000rpm，離心10分鐘； 然后吸取上清液，加入等體積的氯仿：異戊醇（體積比24:1)和上面的步驟一樣，抽提一次，取上清 這兩步試驗(yàn)可以反復(fù)三次，主要是去除蛋白質(zhì)和糖類等雜質(zhì)。 最后加入1/10體積的3M的醋酸鈉（.PH5.3），2倍體積的無水乙醇沉淀DNA。 －20度放置30分鐘，室溫15000rpm,離心10分鐘，沉淀用70％的乙醇洗滌去除鹽分，稍微干燥后，加入適量的緩沖液溶解。－20度冰箱中保存。 解答2：yangguoxing888 應(yīng)該和上下顛倒的時(shí)間沒關(guān)系。沒準(zhǔn)是你基因組提取后溶解，如果緩沖液多得話DNA濃度會(huì)低，這樣也不一定能跑出來，至于前端的東西，沒準(zhǔn)是RNA。 解答3：tsguest 你上下顛倒混勻的時(shí)間太長(zhǎng)了，這樣容易把DNA弄斷，而且如果你要是需要大片段的DNA，這樣做更是不行。你如果把DNA一提出來，馬上就跑，有可能就什么也跑不出來，你可以用TE溶了DNA后，在4度放置一晚，第二天再跑電泳就有可能有你提的DNA， 解答4：yzh-1999 說太劇烈導(dǎo)致鏈斷裂，最后使得溶液渾濁這個(gè)說法太牽強(qiáng)。 我還是同意樓主說的，是消化不徹底的問題。我抽提RNA時(shí)，若樣本太多，導(dǎo)致Trizol不夠用的時(shí)候，也會(huì)出現(xiàn)大量的渾濁。我想可能是你沒有加蛋白酶K，或量太少，導(dǎo)致蛋白消化不徹底，所以后續(xù)加酚不能使它沉淀分層。 冷凍后，這些懸在溶液中的蛋白析出，很正常。 所以，從消化開始，再注意點(diǎn)。 解答5：insect2004 你用的EB染色是不是濃度太低，或用的時(shí)間太長(zhǎng)，把EB換成新的，另外加上MARK, 這樣如果MARK跑出來而你的DNA沒有跑出來，那就說明不是染色的問題，你再找別的原因，如果你不是用試劑盒提得，那你就檢查一下你的關(guān)鍵試劑有沒有問題，原因得一步步找，實(shí)驗(yàn)做得多了，你的經(jīng)驗(yàn)也就多了，你再多提幾次 解答6：yzh-1999 前面那些彌散條帶可能是RNA，降解的DNA等等。 建議重新配制和準(zhǔn)備試劑， 消化時(shí)間長(zhǎng)一些，比如甚至可以將正在消化的樣品在37度的搖床上過夜 解答6：insect2004 把樣品保存在－80度，保存1－2年不會(huì)有問題，如果你們實(shí)驗(yàn)室沒有超低溫冰箱，那你就把樣品保存在－20度，保存一兩個(gè)月應(yīng)該沒有問題。關(guān)鍵試劑重新配，也不費(fèi)多少事 主題20：求助DNA提��！ 鏈接：http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=597267&fpage=187 解答1：guohuayin 首先你先檢測(cè)一下你的有沒有提取出DNA，這個(gè)問題你可以先測(cè)定吸光度，同時(shí)也可以測(cè)定一下純度，確定提取出來DNA后，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的基因。擴(kuò)增的時(shí)間一定要加入對(duì)照，看看PCR體系有沒有問題。 解答2：自然風(fēng) 你的試劑盒加酶之后處理的時(shí)間是不是比較短？因?yàn)樵噭┖信c常規(guī)提DNA的方法的差別之一就是試劑盒酶處理的時(shí)間要短得多，可能有這方面的原因。 另外，你的試劑盒是否是用柱子回收的？可以試試用常規(guī)的酚氯仿代替柱子回收看看，因?yàn)閷?duì)于大片段的DNA，用柱子回收效果稍差。 還有，是不是因?yàn)闃悠返牧勘容^少，才導(dǎo)致檢測(cè)不清楚？ 解答3：bioartist 提取總DNA，破胞很關(guān)鍵！！ 上海生工的試劑盒都是用于一般菌體的提取，對(duì)胞外多糖多的細(xì)菌和革蘭氏陽性菌，一般都比較難提取！ 另外，有時(shí)候，試劑盒提取的DNA量非常少，電泳檢測(cè)不到，但可以用于PCR擴(kuò)增目的基因，其他操作不宜！ 其實(shí)許多傳統(tǒng)的方法提取效果都很好的！！ 解答4：xiaopu_yin 你抽提的是細(xì)菌、放線菌還是酵母？我用的是博達(dá)泰克的試劑盒，一般用液氮或在－80度反復(fù)凍融幾次就會(huì)有較好的效果。總之破胞很重要，而菌體量過多有時(shí)效果反而不好。 |
9樓2008-08-15 17:27:11
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第一章 DNA提取與純化 主題21：關(guān)于細(xì)菌DNA提取 鏈接：http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=613415&fpage=176 解答1：自然風(fēng) 芽孢桿菌是陽性菌，溶菌酶終濃度一般需要3mg/ml，可能是你的對(duì)照菌株是陰性菌，所以效果較好。酶一般需要保存在—20度（還要避免反復(fù)凍融），4度保存很容易失活。 解答2：lingyu20071001 有的陽性菌較難破壁，可以把多加點(diǎn)溶菌酶，對(duì)基因組影響應(yīng)該并不太大， 解答3：goses G+細(xì)胞壁都狂厚，代表菌就是金葡了，不過提DNA一般用不上溶菌酶。提質(zhì)粒是必須用的，我加的5mg/ml，37度應(yīng)該40-60m，每隔10分鐘混懸一次。 溶菌酶最好是粉末存-20，現(xiàn)用現(xiàn)配，溶液存4度不能超過1周 主題22：洗滌DNA有什么技巧么? 鏈接：http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=605008&fpage=176 解答1：wujiequn 個(gè)人感覺先把70%的乙醇輕輕倒掉，但不要把EP管倒置于吸水紙上，剩余的一點(diǎn)溶液用小槍吸掉比較好，這時(shí)候自然晾干也比較快。 電吹風(fēng)干燥一般沒什么影響，有時(shí)候吹得太干了可能會(huì)把DNA也吹跑了。 解答2：xuuue 根據(jù)外觀可以初步判斷提取質(zhì)量，好的DNA 沉淀為白色，干后透明；如果干后仍呈白色，常因蛋白較多；若呈黃至棕色，則是有多酚類雜質(zhì)；呈膠凍狀則含有多糖。 解答3：telomerase 乙醇是直接倒掉（絕大部分）,然后再離心然后用小槍吸凈殘留乙醇 這樣的話很快就干了 ，沒吹過電風(fēng)扇 解答4：wujiequn 不要用吸水紙，太臟了，會(huì)污染。直接用小槍頭吸出剩余的乙醇。沉淀貼壁牢不牢無所謂，吸的時(shí)候注意不要把沉淀吸出來就是了。 解答5：glucidum 一般情況下，用70%乙醇洗的時(shí)候DNA是會(huì)松動(dòng)的，能松動(dòng)是好事。去乙醇的方法像3樓說的那樣就很好。至于吹干方面，一般基因組DNA不建議用吹風(fēng)機(jī)吹干，一個(gè)是怕吹掉，另外一個(gè)原因是干燥過快會(huì)引起基因組DNA斷裂。如果是 質(zhì)粒提取的話，那吹干是沒問題的。如果超凈臺(tái)比較空閑的話，吸掉乙醇以后放超凈臺(tái)吹干其實(shí)也蠻快的。 解答6：angelina-wl 先用70%乙醇洗，12000rpm,2min（可使DNA重新聚在管底）,重復(fù)一次，用無水乙醇洗一次（DNA干燥快一些），放在工作臺(tái)上15~30Min風(fēng)干即可。 主題23：基因組DNA檢測(cè)問題 鏈接：http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=623067&fpage=170 解答1：niure 電泳有沒看到比較亮的條帶啊，有時(shí)候分光光度計(jì)結(jié)果也不要太相信，跑個(gè)PCR看下 解答2：xiaopu_yin 分光光度計(jì)檢測(cè)時(shí)受洗脫所用的溶液有關(guān)，你可以試一下試劑盒提供的洗脫液和雙蒸水，誤差還是比較大的 解答3：yifanyifan 很多其他成分如糖類,蛋白也影響測(cè)定結(jié)果, 如果你有對(duì)照,比如公司合成的引物,可以測(cè)定一下,找找原因.不過大于2.0,理論上應(yīng)該是RNA污染,你加些RNase 處理樣品看看. 解答4：reasonspare 不知道樓主用的什么溶解的DNA，如果是試劑盒的，一半為Tris什么的，這時(shí)候濃度比較大一些。 如果你知道你用的試劑盒是什么東東，就更好了， 因?yàn)榉右灿绊�，胍也影響�?br /> 還有，不要單單看比值，， OD230 和OD260， Od280的實(shí)際值 也不要太低 主題24：放線菌基因組DNA的提取方法 鏈接：http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=628829&fpage=162 (1〕取3ml培養(yǎng)過夜的細(xì)菌培養(yǎng)物離心0.5分鐘，收集菌體； 〔2〕用無菌水洗滌菌體，12000rpm，離心1分鐘； 〔3〕沉淀物加入567 u l TE（pH 8.0）緩沖液，重懸菌體，加入30 u l 溶菌酶（50mg/ml）混勻，于37℃溫育1小時(shí)； 〔4〕加入30 u l 10%的SDS和3 u l （20mg/ml）的蛋白酶K，混勻，于55℃溫育1小時(shí)； 〔5〕加入100 u l 5M Nacl, 充分混勻，再加入80 u l CTAB/Nacl 溶液，混勻，于65℃溫育10min； 〔6〕 加入2ul RNA酶，37℃溫浴15分鐘； 〔7〕加入等體積的酚/氯仿，混勻，抽提； 〔8〕加入等體積的氯仿，抽提一次； 〔9〕 加入1/10體積的3mol/L NaAc 溶液，2倍體積的無水乙醇，混勻，放置－20℃冰箱30分鐘； 〔10〕 輕輕混合直到DNA沉淀下來，離心； 〔11〕 用70%乙醇洗滌沉淀1次，晾干； 〔12〕將已干的DNA溶于40 u l 超純水中，-20℃保存。 解答1：edragonfly 推薦看一本《鏈霉菌遺傳操作手冊(cè)》 建議修改： （2）用25mM的EDTA洗 （3）溫育時(shí)間延長(zhǎng)或增加溶菌酶量（貌似你的菌體不少�。� 如果多糖不是很厲害 第5步可以不要 整體步驟應(yīng)該是沒有問題的。 到（9）應(yīng)該能看到明顯的絮狀沉淀 沒有的話 基本就沒提出來了 解答2：liudanlucky 加入溶菌酶溫浴直到呈均勻粘稠狀。純度要求不是太高的話可以省去5，6步，4步中加入適量EDTA.第9步中直接用預(yù)冷的無水乙醇沉淀也可以。應(yīng)該沒問題，A260/A280可達(dá)到1.8-2.0 主題25：豬肝的DNA提取 鏈接：http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=638159&fpage=162 無解答 |
10樓2008-08-15 17:28:35
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第一章 DNA提取與純化 主題26：提植物DNA時(shí)出現(xiàn)的問題（上清液墨綠色） 鏈接：http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=639732&fpage=156 解答1：wenyangapple 我們實(shí)驗(yàn)室的protocol是這樣的，你參考一下，看看能不能有所啟發(fā)。 200微升CTAB研磨；加300微升CTAB; 65度水浴20分鐘；加氯仿-異戊醇（24:1）震蕩，離心，取上清；加等體積異丙醇，離心棄上清；洗滌，溶解。 我估計(jì)是你用的提取液不好了。 解答2：wdf1980122 轉(zhuǎn)速不夠 解答3：wdgsmv58 離心時(shí)間和轉(zhuǎn)速不夠 解答4：henghengyouyou 深綠色的溶液是對(duì)的，你還要其他幾步在去除蛋白等 解答5：如來神掌 提取液加少了 解答6： glenn_007 加入提取液后，再用氯仿-異戊醇抽提2～3次去除蛋白干擾。每次緩慢顛轉(zhuǎn)50次左右，然后離心，就可以得到上清液了。 主題27：細(xì)菌基因組DNA為什么提不出來？ 鏈接：http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=627321&fpage=155 解答1：reasonspare 如果出現(xiàn)多糖等物質(zhì)需要洗滌幾次，推薦TES， 其他可以用生理鹽水或者滅菌去離子水， 1 ok 應(yīng)該 2 加入TE后加入 lysome 37 度 1 h 或 更長(zhǎng)時(shí)間，或者反復(fù)凍融（-20- 20度）超聲波也可以考慮）總之先打破細(xì)胞壁。 加如 pro K 1h 去蛋白 3 加入 ＳＤＳ 后重復(fù)振蕩，37 度 30min 或更長(zhǎng)， 其他 不變， 解答2：hudong 請(qǐng)你檢查一下你用的所有試劑，試劑出問題的話也是沒有 DNA。如果是一點(diǎn)DNA都沒有的話，那很可能是試劑出問題了。建議重?fù)Q試劑試試，或同時(shí)用其它方法試試。還有，你是小提，不用搖那么多的菌，用試管搖5ml就夠了。 解答3：fengkai6200 我是從肌肉組織提的dna。我加的SDS的量比你大，100ul10%SDS。在55度反應(yīng)2小時(shí)。當(dāng)然因?yàn)榧∪饨M織不好裂解，所以比提菌的DNA多加了SDS，提高了反應(yīng)溫度。 我覺得你可以適當(dāng)?shù)母淖円幌聴l件，加大點(diǎn)SDS的量，或延長(zhǎng)反應(yīng)的時(shí)間。 我這方法提取的DNA質(zhì)量很好的，沒有降解，做pcr的效果也很好的 解答4：li3564617 dna沉淀使用肉眼看不見的，你不妨提完后跑個(gè)電泳看看，上述方法應(yīng)該沒問題，我用上海生工的試劑盒用的方法根你的差不多，效果也不錯(cuò)。 我們用無水乙醇沉淀，加入等體積的無水乙醇，-20攝氏度放置10分鐘，然后4度離心 解答5： edragonfly ctab和DNA在低濃度Na離子時(shí)會(huì)發(fā)生結(jié)合 具體濃度是多少不記得了 自己查一下 解答6：genehsy 第六步中可以加1/10體積的3mol/L的醋酸鈉促進(jìn)DNA沉淀。 另外還有一種簡(jiǎn)單的方法你可以試一試，收集菌體用TE懸浮后直接用等體積的苯酚：氯仿（1：1）混合液直接抽提，離心取上清液，醇沉即可。 解答7：wbz66 DNA提取之后是看不見的,能看見的是一些蛋白質(zhì)的雜質(zhì),建議跑個(gè)電泳看一下最好 解答8：bbzhangzhang 一個(gè)超級(jí)高手經(jīng)常提醒我，抽提，一定首先把菌或細(xì)胞器充分裂解！ 我個(gè)人強(qiáng)烈建議你在適當(dāng)?shù)牧呀獠襟E加上劇烈渦旋2min，其他步驟暫時(shí)不變，相信會(huì)有作用。另外我查了，“CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）是一種陽離子去污劑，可以從低離子強(qiáng)度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，在這種條件下，蛋白質(zhì)和中性多聚糖仍留在溶液里，在高離子強(qiáng)度的溶液里，CTAB與蛋白質(zhì)和大多數(shù)酸性多聚糖以外的多聚糖形成復(fù)合物，只是不能沉淀核酸。因此，CTAB可以用于從大量產(chǎn)生粘多糖的有機(jī)體如植物以及某些革蘭氏陰性菌（包括E.coli的某些株）中制備純化DNA ”。你看鹽離子濃度是否合乎CTAB結(jié)合與分離核酸的要求，再做調(diào)整 主題28：花生DNA提取出現(xiàn)的問題 鏈接：http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=645796&fpage=153 解答1：deepbluewater 你換SDS法試試？或者用液氮法？其實(shí)CTAB法除多糖的效果較好，但是對(duì)樣品要做些前處理，我作的樣品在CTAB之前需要用乙醇溶液浸泡，你可以試試對(duì)樣品進(jìn)行前處理（例如乙醇溶液浸泡，PVP浸泡【但是PVP浸泡容易導(dǎo)致DNA濃度過低，瓊脂糖凝膠檢測(cè)時(shí)條帶不明顯】） 解答2：glenn_007 離心后，取上清電泳試試？我覺得你應(yīng)該是提取到了 SDS法適合蛋白含量較高的樣品，CTAB適合多糖成分含量較高的樣品。視具體情況而定 主題29：細(xì)菌基因組DNA抽提的問題（多條帶） 鏈接：http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=662031&fpage=139 無解答 主題30：氧顆粒污泥總DNA提�。ǜ诫娪緢D） 鏈接：http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=675053&fpage=138 解答1：xiaoyu1014126 你把土樣都放冰箱里，有些能產(chǎn)芽孢的菌都產(chǎn)生芽孢，這對(duì)實(shí)驗(yàn)啊有影響�。� 解答2：lxlxyc CTAB/NaCL在溫度低的情況下結(jié)晶，放在65攝氏度水浴，直到結(jié)晶徹底溶解。水浴時(shí)不停搖動(dòng)。 |
11樓2008-08-15 17:29:48
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第一章 DNA提取與純化 主題31： DNA提取電泳圖分析（拖尾，點(diǎn)樣孔亮） 鏈接：http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=695090&fpage=127 解答1：marongfeng 點(diǎn)樣孔處比較亮，可能就是多糖比較多。拖尾的話可能是輕微的講解吧。至于做雜交就不知道可不可以了。如果做測(cè)序肯定要純化。 解答2：fw1980613 點(diǎn)樣孔的是雜質(zhì)，提取用的樣品最好用鮮樣。 最好別用做雜交。 雜交選擇質(zhì)量好的DNA。 解答3：JayKing999 點(diǎn)樣孔有亮度應(yīng)該是實(shí)驗(yàn)操作的問題。電泳時(shí)盡量小心的將將槍頭深入點(diǎn)樣孔后再打出，DNA放置時(shí)間長(zhǎng)有降解對(duì)雜交應(yīng)該沒太大的問題。我們實(shí)驗(yàn)室有用了半年的DNA做PCR、雜交都沒問題。 主題32：DNA提取問題（酚仿抽提后離心總是出現(xiàn)混濁，離不下去） 鏈接：http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=399218&fpage=127 解答1：浪跡天涯 可能是你的樣品混有其他雜質(zhì)。 解答2：eleenjane 試劑的問題？ 解答3：heda0691 把轉(zhuǎn)速提高些試試（10000-12000rpm，10min），好象有點(diǎn)效果。 解答4：suneternal 我覺得可能是中間乳化劑的問題，另外可能是溫度比較低。 我也經(jīng)常提出DNA，是從動(dòng)物組織中。開始的時(shí)候也出過一些問題，但我盡量能把每一步做到標(biāo)準(zhǔn)化，現(xiàn)在是基本沒出過問題了。 我覺得你加入樣品多少（磨完后在加CTAB前稱一下樣品），加多少CTAB，再加多少酚氯仿，最好都有一個(gè)比例。這樣做雖然有點(diǎn)繁瑣，但我覺得中間出了問題也好知道在哪里。 解答5：yaoqian622 在材料研磨時(shí)要注意材料量，盡量作到研磨成粉狀，用1.5ml離心管裝時(shí)液氮粉的量不要超過0.5ml的線，建議多次離心抽提，適量提高轉(zhuǎn)速，但也不要過高。 主題33：大曲中微生物DNA的提取方法 鏈接：http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=888791&fpage=23 無解答 主題34：關(guān)于HBV DNA提取 鏈接：http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=829660&fpage=53 解答1：wjswj 經(jīng)典的核酸提取方法通常是加去污劑（SDS等）裂解細(xì)胞，經(jīng)蛋白酶處理、有機(jī)溶劑提取及乙醇沉淀等步驟。（全部解答見鏈接）。 主題35：請(qǐng)教熱裂解法提取細(xì)胞DNA（在50個(gè)細(xì)胞中得到基因組DNA） 鏈接：http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=845366&fpage=45 無解答 |
12樓2008-08-15 17:30:31
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第二章 RNA提取與純化 主題1：RNA電泳只有5S 鏈接：http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=910041&fpage=2 解答1：jasco 降解 解答2：raindrop8316 降解了；時(shí)間跑長(zhǎng)了（5s和18s都跑出去了，就剩28s了） 主題2：哪位用TRIzol法提過櫻花的總RNA? 鏈接：http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=481566&fpage=259 解答1：johnsooh 如果你是平行作的煙草、番茄可以提的出來，而櫻花、櫻桃、桃子提不出來，那么可能要求更改針對(duì)特殊植物樣本的提取方法了，可是，如果不是平行操作，平行電泳檢測(cè)，則不能說明方法有問題，建議重新作 解答2：telomerase 從富含多糖的植物組織中提取和純化RNA （方法詳見鏈接 8樓） 主題3：SDS/酚法提植物RNA 為什么沉淀不是白色 鏈接：http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=595187&fpage=188 解答1：reasonspare 沒有關(guān)系， 你比如說提取的是植物葉片或莖， 無論你研磨多小， 都會(huì)有些色素干擾，所以 操作的質(zhì)量好不好，關(guān)鍵看結(jié)果，如果結(jié)果不好： 如果是降解了，那就從防止RNase 入手，如果提到的量少，或者有DNA 或蛋白的污染， 就要從操作上改進(jìn)，具體怎么改進(jìn)，我覺得這個(gè)方法很成熟，只有工作做到位，肯定能出來。。。。。。 解答2：guohuayin 你提取的RNA中有色素，也就是說你在吸取上清的時(shí)候，盡量少吸些，寧缺勿濫，只要提取的RNA質(zhì)量好，肯定能反轉(zhuǎn)錄出來，我試過，我提取的RNA也含有色素，但是RNA質(zhì)量好，也反轉(zhuǎn)錄出來了 主題4：RNA提取OD260/280>4.0? 鏈接：http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=504545&fpage=246 解答1：輕5飛揚(yáng) 有沒可能是你提的不錯(cuò),但跑電泳時(shí)上樣太高,以致看到拖影,至于OD值么,呵呵,我覺得一般來講都不是很準(zhǔn),當(dāng)然4可能確實(shí)有些太過了,呵呵,你做什么呀,如果要求一嚴(yán)格的話,直接RT一下,有你要的東西不就OK了么 解答2：yang22181 拖影應(yīng)該是降解的結(jié)果吧！? OD值的比值肯定錯(cuò)誤！檢查你的分光光度計(jì)（找個(gè)已知濃度溶液）和比色杯（應(yīng)用配套石英杯）！ 解答3：lanyu270 降解了，肯定>2.2為降解。 解答4：fruit 有不同的溶液OD值是不同的，用DEPC水可能會(huì)偏低，有tris可能會(huì)偏高，用蒸餾水試試。 主題5：花的RNA提取問題 鏈接：http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=518971&fpage=208 解答1：puma2003 是不是花中的本來含量就少啊 解答2：wpszy2000 短鏈的RNA用這種方法不行的，要用超離心法！ 解答3：hn8265 花的含水量如果高的話，在提取的時(shí)候很易被降解。你可以試試少放些樣品，或多加些Tirzol. 解答4：鯨魚001 試試其他方法，用LiCL沉淀法看看，能不能行，還有你的花最好不要帶露水。 氯化鋰沉淀法很容易可以搜到。 |
13樓2008-08-15 17:31:25
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????? RNA??????? ????6?????RNA extraction????????? ?????http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=574242&fpage=203 ???? ????7???????????????????RNA?????? ?????http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=613045&fpage=170 ???1??xyzwujun RNA??????????????????????????????????? ???2??telomerase ????????????????????Э????????????????????????????????? ??????-80??????????????????????????????????????????????? ???3????? ??????????????????????-50??????6????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????У????????????????????? ???4??kklkimo 1. ??B???????z?w????B??(-196 C; ?^Σ?U)?????(-45C; ?^???) ????o??????n????????????????M?????(?????????)??????????Tri-reagent or Trizol ??4C????????????????? 2. ?z?w???L?????F????RNA Later (Qiagene or Sigma) reagnet ?????á??????m??reagent ?????oRNA????????Ч??????e??????豣????-80C???? ????8?????RNA????? ?????http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=668040&fpage=142 ???1??hyf9901 ????????07???????????????????????????????RNA??? ???2??xiding Wan CY, Wilkins TA (1994) A modified hot borate method significantly enhances the yield of high-quality RNA from cotton (Gossypium hirsutum L.). Anal Biochem. 223: 7?C12 ????9??23S rRNA??????? ?????http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=726982&fpage=104 ???? ????10?????RNA??? ?????http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=920650&fpage=1 ???1????? invitrogen????????????trizol,Ч??????????????????????????????Ч??????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????trizol????????????????????????????????????????????????м??????????????????????????rna?ǹ??????С???????????????????RNA??????????????漸??????????????У???????trizol???????????depc?????????????? |
14樓2008-08-15 17:32:32
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第二章 RNA提取與純化 主題11：提RNA后測(cè)得OD值比為2.3,電泳什么都沒有 鏈接：http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=759097&fpage=95 解答1：輕5飛揚(yáng) 如果提出來了,那么無論你如何電泳,只要沒有上RNase消化,至失會(huì)有一條非常亮的5S表明的你RNA降解了,如果你什么也沒看到,那可能你什么也沒提出來,不知道沉淀完后能看到EP管中有白色沉淀么? 主題12：mRNA 分離純化后，電泳是2條帶，沒有smear. 鏈接：http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=776594&fpage=81 無解答 主題13：RNA提取（在渦旋器上渦旋會(huì)不會(huì)震斷RNA） 鏈接：http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=860874&fpage=38 解答1：raindrop8316 我們?cè)瓉碛肔iCl法（不是試劑盒)提真菌的RNA，也是要求加完裂解液后在渦旋器上渦旋，提出來的效果也蠻好的，斷了沒有我就不知道了，我們只是用來做簡(jiǎn)單的RT-PCR，能做出來就是了 |
15樓2008-08-15 17:33:39
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第三章 質(zhì)粒提取與純化 主題1：提取質(zhì)粒時(shí)為什么總是有總DNA？ 鏈接：http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=617672&fpage=175 解答1：jiasanlin 如果是堿裂解發(fā)提取質(zhì)粒的時(shí)候，一般裂解時(shí)間長(zhǎng)的化就會(huì)混入genome DNA,一般情況下加入溶液2后只要看到菌液清亮，就要馬上加入溶液3 終止。變清亮的時(shí)間跟收集菌體的量和溶液2的用量有關(guān)，分子克隆手冊(cè)上的不要超過5分鐘，只是一個(gè)大概的時(shí)間。 解答2：guohuayin 前三步越快越好，并且動(dòng)作一定要輕柔，不然會(huì)造成大量的基因組DNA斷裂。 解答3：angelina-wl 加溶液2后動(dòng)作要輕柔,也要快.不然會(huì)打斷總DNA,在電泳檢測(cè)時(shí)在靠近口的地方就能看見. 解答4： 隨風(fēng)而過 實(shí)在沒辦法，你就跑個(gè)電泳切膠回收質(zhì)粒，質(zhì)粒的分子量你應(yīng)該知道吧。提取質(zhì)粒的時(shí)候加容易2的時(shí)候要輕柔，最好只是輕輕的顛倒幾次就行，千萬不要用渦旋混勻器，否則動(dòng)作大了就會(huì)打斷總DNA的 主題2：如何抽提較大的質(zhì)粒 鏈接：http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=400060&fpage=160 解答1：wwwkkk83 超純度大型質(zhì)粒的抽提試劑盒 專門用于純化小于250kb的BAC、PAC、P1或粘粒DNA，可徹底去除基因組DNA的污染。 貨名 規(guī)格 貨號(hào) 價(jià)格 QIAGEN large-Construct Kit 10perps 12462 4338 解答2：輕5飛揚(yáng) 質(zhì)粒大,所以拷貝會(huì)少自然提出的也少,用堿法提應(yīng)該可以,多集些菌,然后蛋白那部多抽些應(yīng)該會(huì)好些,最后消化時(shí)間也略長(zhǎng)些吧,2h可以試一下 解答3： 隨風(fēng)而逝 減法抽提的量確實(shí)比較大，我們實(shí)驗(yàn)室都是用這種方法抽30000左右的大質(zhì)粒的。你的量比較少可能有以下幾個(gè)問題： 1. 大質(zhì)粒不能保菌，每次都要轉(zhuǎn)化質(zhì)粒，調(diào)斑。剩余的部分菌液，趕在第二天前大擴(kuò)。千分之一加菌液，青霉素千分之一稍小些。 2. 搖菌時(shí)間保證十二小時(shí)，時(shí)間稍長(zhǎng)，大質(zhì)粒會(huì)迅速消失 主題3:如果提取這種菌的質(zhì)粒和RNA (洋蔥伯克氏菌，G- 細(xì)菌) 鏈接：http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=725282&fpage=115 無解答 主題4：質(zhì)粒提取結(jié)果兩條帶是為什么（疑為基因組DNA） 鏈接：http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=767741&fpage=87 解答1：lauren180 延長(zhǎng)堿變性時(shí)間 解答2：yuanzhiqin.119 試試在提取液上想想辦法，本質(zhì)跟延長(zhǎng)時(shí)間是一樣的 解答3：linfeng196 我覺得有三種可能，一是細(xì)菌基因組的污染，解決的辦法是加入溶液II的時(shí)候操作要輕柔，不要?jiǎng)×�，還要控制時(shí)間，二可能是你的質(zhì)粒的狀態(tài)不好，如果你的質(zhì)粒狀態(tài)好的話，大多數(shù)應(yīng)該以超螺旋形式存在，而你的都是線性的，沒有超螺旋的，所以那個(gè)可能是開環(huán)狀態(tài)的質(zhì)粒，我覺得第二種可能性更大些 。第三種可能是已經(jīng)發(fā)生了質(zhì)粒的整合 主題5：質(zhì)粒電泳求助（沒有條帶) 鏈接：http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=780570&fpage=79 解答1：xxh8372 是不是上樣有些少啊？ 解答2： 十比 應(yīng)該以電泳為準(zhǔn)，分光光度計(jì)不準(zhǔn)的�？赡苜|(zhì)粒提得有問題 主題5：質(zhì)粒提不出來？ （保存的菌種在AMP中可見長(zhǎng)，但質(zhì)粒提不出） 鏈接：http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=876309&fpage=30 解答1：jasco 菌液劃線，挑單菌落，再液體培養(yǎng)重新抽質(zhì)粒 解答2：duanyongzhong 可能是你的菌種已經(jīng)被污染了，在這種情況下，菌體內(nèi)含有amp抗性基因，但并沒有質(zhì)粒的存在，所以你提不到質(zhì)粒，我考慮是這種原因。檢驗(yàn)?zāi)愕氖荏w菌是否被污染。 [ Last edited by raindrop8316 on 2008-8-19 at 08:47 ] |
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reasonspare
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