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zhangzhu8912木蟲 (正式寫手)
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[求助]
有關(guān)熒光定量PCR的技術(shù)和多重熒光定量pcR
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具體講講多重熒光定量pcr吧 ， [ Last edited by zhangzhu8912 on 2011-6-28 at 09:04 ] |
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2樓2014-06-13 00:19:23
Explor
新蟲 (正式寫手)
- 應(yīng)助: 10 (幼兒園)
- 金幣: 1554.8
- 散金: 88
- 紅花: 2
- 帖子: 775
- 在線: 168.8小時
- 蟲號: 8160133
- 注冊: 2018-03-05
- 專業(yè): 生物化學(xué)
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BIOGHSC Super MultProbe One Kit專為以RNA為模板的定量PCR檢測而設(shè)計，適合熒光探針法定量PCR分析，逆轉(zhuǎn)錄和定量PCR在一個反應(yīng)管內(nèi)一步完成，操作簡便快速。 常規(guī)的qPCR，在一個反應(yīng)管中僅檢測單一指標，如果檢測的指標很多或者檢測的樣本很多，對qPCR試劑以及樣本無疑是一種巨大的浪費。在多重qPCR中，單反應(yīng)管擴增檢測多個靶標。每一個靶標都被一套不同（或相同）的引物擴增，并且一個特異的探針區(qū)分每一個PCR擴增。因此，你可以快速測量幾個靶標或目的基因的表達水平。這種多個指標在單個反應(yīng)管中同時完成檢測的方法極大地減少了相關(guān)試劑的用量，即使擁有足夠的qPCR酶，多重qPCR也會節(jié)省您的樣本處理時間及其他試劑耗材。 多重qPCR的要求——以探針法為主 由于多個指標是在一管內(nèi)完成檢測，要區(qū)分這幾個指標的信號，就無法使用常規(guī)的SYBR Green I染料來標記擴增產(chǎn)物。水解探針法是最常用的解決方案，即針對每一個指標，設(shè)計特異性的探針，利用不同探針上標記的不同波長的熒光基團來區(qū)分每個指標的熒光變化。 多重qPCR探針的熒光基團的要求 1. 避免熒光基團相互干擾 多重qPCR的實驗設(shè)計要求比單一反應(yīng)體系的要復(fù)雜的多。檢測不同指標的探針必須攜帶不同光譜范圍的熒光基團。下圖是幾種常用的熒光基團的發(fā)射光譜（圖片來自于IDT），由圖中可見，很多熒光光譜相近的熒光基團，它們雖然最大發(fā)射波長不同，但是在附近的波段內(nèi)還是會有相互重疊的，一定要避免熒光基團發(fā)射光譜之間的相互干擾。 2. 根據(jù)熒光強度分配檢測指標 不同熒光基團的熒光強度是有高有低的，例如FAM就是一個熒光強度相對較高的基團，我們偏向于將其安排給相對表達量比較低的目的基因，而熒光強度相對較低的基團可以用于檢測表達量比較高的如看家基因等，這樣會達到擴增曲線平臺期接近的目的，結(jié)果會比較美觀。 3. 按照熒光定量PCR儀來選擇熒光基團 不同熒光定量PCR儀的激發(fā)光和發(fā)射光都是不相同的，因此需要根據(jù)對應(yīng)的儀器選擇適配的熒光基團。目前最廣泛通用的熒光基團為FAM（FITC），因此，絕大多數(shù)多重qPCR策略首選的一個通道為FAM。如果使用儀器不適配的熒光基團，則在此之前必須對儀器針對這種熒光基團進行矯正。目前，主流的熒光定量PCR儀還是能夠支持較多通道的多重檢測的，小編根據(jù)IDT的數(shù)據(jù)進行了整理，貢獻出下表供您選擇： 4. 搭配淬滅基團的選擇 在選完探針的熒光基團之后，根據(jù)熒光基團的種類搭配淬滅基團即可，多重qPCR并不要求淬滅基團的不同，例如兩重qPCR分別選擇了FAM及VIC作為熒光基團，淬滅基團可以統(tǒng)一選擇BHQ-1。 |
3樓2019-11-04 16:45:12
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