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[求助]
畢赤酵母電轉(zhuǎn)
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做了很久畢赤酵母GS115的電轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)的是DNA片段，雙交換敲除基因。 轉(zhuǎn)化方法用的是Wu S, Letchworth G J. High efficiency transformation by electroporation of pichia pastoris pretreated with lithium acetate and dithiothreitol[J]. Biotechniques, 2004, 36(1): 152-155 1. 50mlYPD搖菌至OD 1.5~2.0 2. 收集菌體。每10ml作一管收集，即為一個(gè)感受態(tài) 3. 每管以8 mL LDST（ 100 mM LiAc, 10 mM DTT,0.6 M sorbitol, and 10 mM Tris-HCl, pH 7.5）室溫處理30min 4. 4℃離心。以1ml預(yù)冷的1M 山梨醇洗三次 5. 最后以80微升預(yù)冷的1M 山梨醇重懸。感受態(tài)濃度約為10^10個(gè)細(xì)胞/mL 電轉(zhuǎn)條件1500V，25μF，200Ω（這個(gè)條件的電轉(zhuǎn)儀要去別的實(shí)驗(yàn)室借用，本實(shí)驗(yàn)有的電轉(zhuǎn)儀是1500V，36μF,186Ω，兩種條件都用過(guò)）。2mm電擊杯。 DNA量10~100ng，溶于5~10μL水中�；旌虾蟊�5min。（電轉(zhuǎn)儀預(yù)熱，電擊杯預(yù)冷）。電擊后迅速加入1ml 預(yù)冷的1M 山梨醇。30℃孵育1.5h。然后加入1mlYPD，150rpm搖2~3h。取200μL涂板（YPD含1M山梨醇，300μg/ml G418） 每次結(jié)果都是長(zhǎng)3~4天無(wú)明顯克隆。5~6天時(shí)長(zhǎng)滿(mǎn)背景克�。ㄓ刑舫鲵�(yàn)證過(guò)，都是假陽(yáng)性）。陰性對(duì)照基本不長(zhǎng)的。前后做了幾十次了。就得到2個(gè)陽(yáng)性克隆。有很多時(shí)候，能長(zhǎng)出幾個(gè)克隆。重新劃線(xiàn)于G418平板上，仍然可以長(zhǎng)，但是提基因組PCR驗(yàn)證都不對(duì)。 做的都快吐了  求蟲(chóng)友們給點(diǎn)意見(jiàn)！[ Last edited by 皇馬鐵衛(wèi) on 2013-7-3 at 15:45 ] |
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 分子生化實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)積累 | 蛋白表達(dá)純化鑒定精華 |
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2樓2013-07-03 15:53:44
lwiaanngg
鐵桿木蟲(chóng) (著名寫(xiě)手)
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
myprayer: 金幣+1, 回答很好，perfect 2013-07-04 17:27:14
皇馬鐵衛(wèi): 金幣+2, ★有幫助, 我轉(zhuǎn)化的是DNA片段，不存在ligation的問(wèn)題哦 2013-07-06 15:46:13
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
myprayer: 金幣+1, 回答很好，perfect 2013-07-04 17:27:14
皇馬鐵衛(wèi): 金幣+2, ★有幫助, 我轉(zhuǎn)化的是DNA片段，不存在ligation的問(wèn)題哦 2013-07-06 15:46:13
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1. 你這個(gè)問(wèn)題比較復(fù)雜，從描述上看，你的ligation做的如何呢？如果你的ligation效果不好，即使你的電轉(zhuǎn)效率再高，你拿到都是背景克隆。如果你的plasmid是transfer vector，可以考慮先用e.coli做完ligation，等提出很好的positive plasmid后再轉(zhuǎn)入酵母中。 2. 個(gè)人建議你做competent cell時(shí)用瓶子而不是管子，呵呵 |
3樓2013-07-04 17:10:43
ericyo918
至尊木蟲(chóng) (知名作家)
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4樓2013-07-04 17:44:48
帶刺毛毛蟲(chóng)
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5樓2013-07-05 10:10:03
hj890509
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6樓2013-07-05 15:50:42
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
皇馬鐵衛(wèi): 金幣+10, 你說(shuō)的問(wèn)題我都注意過(guò)的，還是感謝下 2013-07-06 15:40:36
gyesang: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流！ 2013-07-07 17:31:21
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
皇馬鐵衛(wèi): 金幣+10, 你說(shuō)的問(wèn)題我都注意過(guò)的，還是感謝下 2013-07-06 15:40:36
gyesang: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流！ 2013-07-07 17:31:21
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1.DNA是線(xiàn)性化后嗎？線(xiàn)性化后必須PCR純化，離子對(duì)電轉(zhuǎn)的效率影響很大 2.電壓電阻我覺(jué)得沒(méi)有問(wèn)題，因?yàn)槲覀儗?shí)驗(yàn)室也是一樣的。 3.你使用G418抗性，那應(yīng)該是9K載體吧，可以試試使用MD平板，我們?cè)谑褂脄eocin抗性YPD平板時(shí)，只是30℃孵育1.5h，直接涂布了。后面并沒(méi)有加入YPD等步驟。 4.如果3-4天都沒(méi)有克隆，那就不會(huì)有陽(yáng)性克隆了（實(shí)驗(yàn)室經(jīng)驗(yàn)）。 5.我們實(shí)驗(yàn)室是50mlYPD搖菌至OD 1.5~2.0，直接離心，去上清，加入40mlLDST（現(xiàn)配），30攝氏度孵育30min。LDST一定要現(xiàn)配，里面有DTT......不知道是不是這些問(wèn)題 6.電擊杯是正常的嗎？？之前使用有木有問(wèn)題... 暫時(shí)看到這些問(wèn)題....希望能幫助你 |
7樓2013-07-05 17:18:27
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★
gyesang: 金幣+2, 感謝應(yīng)助！ 2013-07-07 17:31:57
gyesang: 金幣+2, 感謝應(yīng)助！ 2013-07-07 17:31:57
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2013-07-05 17:26:06, 166.4 K
8樓2013-07-05 17:20:04
9樓2013-07-06 15:36:24
10樓2013-07-06 15:37:16
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