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[求助] 相對熒光定量cDNA的問題

求問壇子里的各位大神，我做相對熒光定量，首先提組織RNA，然后反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA做模板做熒光定量，我主要做不同組織里的目的基因的相對表達量，請問我在提各個組織RNA，反轉(zhuǎn)錄后，要不要將各個組織反轉(zhuǎn)錄的cDNA測一下濃度，然后將各個組織的cDNA濃度稀釋調(diào)整到相同的濃度，作為模板做熒光定量。也就是說我需要調(diào)整一下RNA濃度再反轉(zhuǎn)錄，或者是統(tǒng)一一下各個組織的cDNA濃度再作模板嗎。

[ Last edited by thinkerboy on 2013-7-26 at 21:10 ]

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1樓 2013-07-26 21:00:26

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biomed_fanyi

新蟲 (初入文壇)

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myprayer: 金幣+1, 贈人玫瑰手有余香，分子生物期待你的更多精彩 2013-07-27 11:22:44

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2樓2013-07-27 11:19:47

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gaoyang636

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你描述的這個其實就是不同sample之間互相比較時 “均一化”的概念:normalization。
而qPCR常用的均一化手段就是通過一個被認為在不同組織中表達量恒定的基因作為標桿，即內(nèi)參基因，比如actin。

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3樓2013-07-27 19:43:15

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Sthunder

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thinkerboy(gyesang代發(fā)): 金幣+1, 鼓勵回帖交流！ 2013-07-27 21:44:51

沒有實質(zhì)性必要，因為你有內(nèi)參。但在反轉(zhuǎn)錄之前一定要測總RNA濃度，防止?jié)舛冗^高，反轉(zhuǎn)錄酶不足導致反轉(zhuǎn)錄不完全！ Good luck！

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互助互勵，共奮共進��！

4樓2013-07-27 21:15:47

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yb19841014

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gyesang: 金幣+2, 鼓勵回帖交流！ 2013-09-27 17:14:23

個人覺得要測RNA濃度，根據(jù)RNA濃度做逆轉(zhuǎn)錄。帶上你的內(nèi)參，就能相對定量啦

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5樓2013-07-28 19:21:30

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小乖_1990

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kx444555: 金幣+1, 鼓勵交流 2013-07-29 10:04:01

我們一般是根據(jù)RNA的濃度來調(diào)整，先把RNA濃度調(diào)整一致，再反轉(zhuǎn)錄，這樣出來的cDNA的濃度基本就一致了。

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走自己的路，讓別人羨慕嫉妒恨去吧�。。�

6樓2013-07-29 10:02:42

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東晨瀟曉

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kx444555: 金幣+1, 鼓勵交流 2013-09-27 09:54:28

我做半定量時，就是RNA測一次，然后調(diào)整。之后跟管家基因?qū)Ρ取?

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7樓2013-09-27 09:26:34

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gyesang

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反轉(zhuǎn)錄之前的RNA需要測一下濃度，然后取相同量的RNA進行逆轉(zhuǎn)錄，然后取相同量的“RNA”做Realtime，取相同量的RNA做，可以輔助判斷實驗的成敗，理論上同量的RNA即使是不同樣品，內(nèi)參的Ct值是基本一樣的，如果你的內(nèi)參Ct值相差很大，說明你實驗控制的不好

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8樓2013-09-27 17:17:44

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從你的實驗要求來看不需要不同組織的相對表達主要還是看內(nèi)參多皆多少皆少都是呈比例關(guān)系的

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人物

9樓2013-09-27 17:22:07

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