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samqueenw銀蟲 (初入文壇)
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融合蛋白表達(dá)只出現(xiàn)前半部分蛋白條帶 已有4人參與
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最近做融合蛋白，pet21a做載體，融合21kd和28kd的蛋白 構(gòu)建后的載體經(jīng)測(cè)序沒有問題，前邊21KD蛋白的終止密碼子已經(jīng)被去除，但是表達(dá)誘導(dǎo)后SDS凝膠電泳只在21KD的位置有表達(dá)條帶（表達(dá)條件：37度；分別試了OD600=0.5,0.7,1.0; IPTG終濃度為0.3,0.5,1.0mM；誘導(dǎo)1h，3h，過夜。最后發(fā)現(xiàn)只要誘導(dǎo)過夜，就會(huì)有出現(xiàn)表達(dá)條帶） 請(qǐng)各位做過融合蛋白的高手賜教啊  |
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chlorella409
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4樓2013-12-13 08:41:07
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【答案】應(yīng)助回帖
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samqueenw(kx444555代發(fā)): 金幣+3, 鼓勵(lì)交流 2013-12-20 15:26:26
samqueenw(kx444555代發(fā)): 金幣+3, 鼓勵(lì)交流 2013-12-20 15:26:26
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樓主這種情況我也遇到過,以下是我的經(jīng)驗(yàn),希望對(duì)你能有幫助: 我有一個(gè)蛋白怎么表達(dá)都不溶,沒有辦法了只好做了個(gè)融合蛋白,N端的是可溶的標(biāo)簽蛋白 但是IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的結(jié)果是只看到了對(duì)應(yīng)于融合的N端的可溶標(biāo)簽蛋白有很強(qiáng)誘導(dǎo)條帶, 融合蛋白的全長(zhǎng)條帶很弱或者幾乎看不到. 用N端his-tag做純化可以拿到混合物,其中對(duì)應(yīng)于前半部分的條帶明顯比對(duì)應(yīng)于融合蛋白全長(zhǎng)的條帶要深 我把全長(zhǎng)融合蛋白用HPLC分離出來, 然后用酶把融合蛋白從中間切開,結(jié)果后半部分就全部都沉淀了,上清夜里只有前半部分 我推測(cè)是因?yàn)槿诤系鞍椎暮蟀氩糠直旧聿荒苷_折疊, 所以e.coli.的某種機(jī)制就會(huì)傾向于把折疊和溶解度特別好的前半部分切下來. 而且對(duì)于融合蛋白來說, 兩個(gè)融合部分的連接處本來也沒有結(jié)構(gòu),也容易被各種蛋白酶非特異性地切開 |
6樓2013-12-20 03:42:31
samqueenw
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2樓2013-12-05 13:12:33
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3樓2013-12-13 08:33:25
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8樓2013-12-20 10:28:59
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9樓2013-12-20 11:22:39
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10樓2013-12-20 13:00:13
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