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SDAUWY新蟲 (初入文壇)
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[求助]
分子新手，PCR產(chǎn)物回收濃度太低，請教各位蟲友！ 已有6人參與
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| 本人剛開始接觸分子方面的試驗，準(zhǔn)備做RNA干擾，目前正用帶T7的引物跑PCR，產(chǎn)物帶挺亮，然后用天根的試劑盒切膠回收的濃度太低，一般都在30ng/μl左右。我后續(xù)要用這個回收產(chǎn)物做模板走promega T7BiboMAX Express RNAi System 這個試劑盒的程序，要求模板量在1 μg，但我的回收產(chǎn)物遠(yuǎn)不夠這個量，請教各位蟲友怎么提高回收產(chǎn)物的量，或者有做過這個的我想請教下整個過程，非常感謝！ |
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切記水一定要滴到膜上面，否則回收產(chǎn)物溶不下來。 
6樓2015-06-19 11:03:54
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
西門吹雪170: 金幣+3, 鼓勵回帖交流 2015-06-19 20:41:45
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西門吹雪170: 金幣+3, 鼓勵回帖交流 2015-06-19 20:41:45
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我之前做過RNAi實驗，剛開始也和你一樣，DNA模板濃度低上不去，沒法合成RNA，后來試了很多種方法，給你介紹一下： 1、如上面蟲友所說，多做幾個PCR重復(fù)，我50uL反應(yīng)體系做了5個重復(fù)，最后會收到一起，20uL水依次洗脫5個柱子，最后濃度能達到200到300之間； 2、也是多做幾次PCR重復(fù)，最后將所有PCR產(chǎn)物混合在一起，加入2倍體積無水乙醇和1/10體積醋酸鈉，充分混勻后放在-20℃冰箱半個小時以上，之后以離心機最大轉(zhuǎn)速（12000rpm以上）離心15min，再用75%乙醇洗滌，同樣采用最大轉(zhuǎn)速離心，最后加20uL水溶解即可，取其中1uL電泳檢測。此法回收產(chǎn)物可能含有雜質(zhì)，但只要沒有非特異性擴增而且引物二聚體較少即可，此法回收效率比試劑盒高很多，可以一試 |
8樓2015-06-19 20:37:43
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