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SDAUWY新蟲 (初入文壇)
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[求助]
分子新手，PCR產(chǎn)物回收濃度太低，請教各位蟲友！ 已有6人參與
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| 本人剛開始接觸分子方面的試驗(yàn)，準(zhǔn)備做RNA干擾，目前正用帶T7的引物跑PCR，產(chǎn)物帶挺亮，然后用天根的試劑盒切膠回收的濃度太低，一般都在30ng/μl左右。我后續(xù)要用這個回收產(chǎn)物做模板走promega T7BiboMAX Express RNAi System 這個試劑盒的程序，要求模板量在1 μg，但我的回收產(chǎn)物遠(yuǎn)不夠這個量，請教各位蟲友怎么提高回收產(chǎn)物的量，或者有做過這個的我想請教下整個過程，非常感謝！ |
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 分子生物知識 | 蛋白表達(dá)純化鑒定精華 |
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【答案】應(yīng)助回帖
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SDAUWY(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+2, 鼓勵回帖交流 2015-06-19 20:41:31
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SDAUWY(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+2, 鼓勵回帖交流 2015-06-19 20:41:31
擴(kuò)PCR多擴(kuò)幾管，電泳鑒定的時候，跟MARKER比對一下，粗略算下濃度。回收的時候，就按正常的步驟回收，但是最后加水溶解的時候，一定記得水滴在回收柱子的膜上面，一般20ul夠了。比如你擴(kuò)了3份，第一個柱子用20ul溶解后，這20ul再加到第二份的柱子膜上面，再溶一次，然后再溶第三個柱子，濃度會提的很高，灰常亮 切記水一定要滴到膜上面，否則回收產(chǎn)物溶不下來。 |
6樓2015-06-19 11:03:54
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
西門吹雪170: 金幣+3, 鼓勵回帖交流 2015-06-19 20:41:45
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西門吹雪170: 金幣+3, 鼓勵回帖交流 2015-06-19 20:41:45
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我之前做過RNAi實(shí)驗(yàn)，剛開始也和你一樣，DNA模板濃度低上不去，沒法合成RNA，后來試了很多種方法，給你介紹一下： 1、如上面蟲友所說，多做幾個PCR重復(fù)，我50uL反應(yīng)體系做了5個重復(fù)，最后會收到一起，20uL水依次洗脫5個柱子，最后濃度能達(dá)到200到300之間； 2、也是多做幾次PCR重復(fù)，最后將所有PCR產(chǎn)物混合在一起，加入2倍體積無水乙醇和1/10體積醋酸鈉，充分混勻后放在-20℃冰箱半個小時以上，之后以離心機(jī)最大轉(zhuǎn)速（12000rpm以上）離心15min，再用75%乙醇洗滌，同樣采用最大轉(zhuǎn)速離心，最后加20uL水溶解即可，取其中1uL電泳檢測。此法回收產(chǎn)物可能含有雜質(zhì)，但只要沒有非特異性擴(kuò)增而且引物二聚體較少即可，此法回收效率比試劑盒高很多，可以一試 |
8樓2015-06-19 20:37:43
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