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小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 分子生物 » DNA重組 » 酶切連接不成功
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餓的神啊新蟲 (著名寫手)
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[求助]
酶切連接不成功 已有1人參與
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我想構建一個發(fā)夾結構用于RNAi，把長片段插入T載體(下游引物上有ClaI酶切位點），然后通過XhoI和ClaI雙酶切短片段（上游引物加了XhoI，下游引物加ClaI）和長片段質粒，NEB的內(nèi)切酶，酶切了一個小時，然后膠回收，用的promega T4連接酶連接，室溫2h，然后轉化，可是篩選出來的都只有長片段，沒有短片段，說明連接沒成功，是哪里的問題呢？ 發(fā)夾結構是不是長片段用正向，短片段用反向插入的，不然接頭對不上啊，但是沒有成功？我怕自己搞錯了方向，后來沒有把短片段連T載體，直接把PCR產(chǎn)物膠回收后雙酶切了，還是沒有成功。我又把篩選的反向插入的長片段作為模板，擴增短片段，然后把PCR產(chǎn)物雙酶切，可是還是不成功，到底是為什么啊 @youlinglyw @biostar2009 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
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star013 
新蟲 (知名作家)
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3樓2016-10-13 12:00:53
餓的神啊
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2樓2016-10-13 11:32:25
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4樓2016-10-13 21:44:22
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樓主，你好，我最近構建表達載體，也用到了和你的差不多的技術，我可以請教你一下嗎？酶切之后連接完了不可以直接PCR驗證嗎？為什么還要做轉化呢？是不是因為連接后的反應液太少，然后轉化擴繁要增大量呢？ 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
5樓2016-10-22 21:59:59
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