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餓的神啊新蟲 (著名寫手)
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[求助]
酶切連接不成功 已有1人參與
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我想構(gòu)建一個發(fā)夾結(jié)構(gòu)用于RNAi，把長片段插入T載體(下游引物上有ClaI酶切位點(diǎn)），然后通過XhoI和ClaI雙酶切短片段（上游引物加了XhoI，下游引物加ClaI）和長片段質(zhì)粒，NEB的內(nèi)切酶，酶切了一個小時，然后膠回收，用的promega T4連接酶連接，室溫2h，然后轉(zhuǎn)化，可是篩選出來的都只有長片段，沒有短片段，說明連接沒成功，是哪里的問題呢？ 發(fā)夾結(jié)構(gòu)是不是長片段用正向，短片段用反向插入的，不然接頭對不上啊，但是沒有成功？我怕自己搞錯了方向，后來沒有把短片段連T載體，直接把PCR產(chǎn)物膠回收后雙酶切了，還是沒有成功。我又把篩選的反向插入的長片段作為模板，擴(kuò)增短片段，然后把PCR產(chǎn)物雙酶切，可是還是不成功，到底是為什么啊 @youlinglyw @biostar2009 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
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樓主，你好，我最近構(gòu)建表達(dá)載體，也用到了和你的差不多的技術(shù)，我可以請教你一下嗎？酶切之后連接完了不可以直接PCR驗(yàn)證嗎？為什么還要做轉(zhuǎn)化呢？是不是因?yàn)檫B接后的反應(yīng)液太少，然后轉(zhuǎn)化擴(kuò)繁要增大量呢？ 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
5樓2016-10-22 21:59:59
餓的神啊
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2樓2016-10-13 11:32:25
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3樓2016-10-13 12:00:53
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4樓2016-10-13 21:44:22
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6樓2016-10-30 23:17:53
choujiaoqi
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連接有順反之分，還有很多非特異連接。要用載體就是為了獲得大量純凈的片段。也可以為了下一步研究做準(zhǔn)備。常見有克隆載體和表達(dá)載體 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
7樓2016-10-31 00:17:27
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謝謝你的解答，我還有個問題，因?yàn)槲野涯康钠尾迦胼d體之后是要通過PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)，而這一步需要線性化得DNA片段，那我把我構(gòu)建的表達(dá)載體單酶切線性化后還會影響表達(dá)載體的表達(dá)嗎？謝謝 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
8樓2016-10-31 08:57:55
choujiaoqi
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如果你需要把載體轉(zhuǎn)染到細(xì)胞表達(dá)的話，就需要成環(huán)的質(zhì)粒，只有在超螺旋狀態(tài)才能進(jìn)去透過細(xì)胞，線性片段就很難通過細(xì)胞膜。所以不需要切開。當(dāng)然你的下有研究我不是很清楚 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
9樓2016-10-31 11:54:39
10樓2016-10-31 15:07:00
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