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餓的神啊新蟲 (著名寫手)
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[求助]
酶切連接不成功 已有1人參與
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我想構(gòu)建一個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)用于RNAi，把長片段插入T載體(下游引物上有ClaI酶切位點(diǎn)），然后通過XhoI和ClaI雙酶切短片段（上游引物加了XhoI，下游引物加ClaI）和長片段質(zhì)粒，NEB的內(nèi)切酶，酶切了一個(gè)小時(shí)，然后膠回收，用的promega T4連接酶連接，室溫2h，然后轉(zhuǎn)化，可是篩選出來的都只有長片段，沒有短片段，說明連接沒成功，是哪里的問題呢？ 發(fā)夾結(jié)構(gòu)是不是長片段用正向，短片段用反向插入的，不然接頭對(duì)不上啊，但是沒有成功？我怕自己搞錯(cuò)了方向，后來沒有把短片段連T載體，直接把PCR產(chǎn)物膠回收后雙酶切了，還是沒有成功。我又把篩選的反向插入的長片段作為模板，擴(kuò)增短片段，然后把PCR產(chǎn)物雙酶切，可是還是不成功，到底是為什么啊 @youlinglyw @biostar2009 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
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4樓2016-10-13 21:44:22
餓的神啊
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2樓2016-10-13 11:32:25
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3樓2016-10-13 12:00:53
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樓主，你好，我最近構(gòu)建表達(dá)載體，也用到了和你的差不多的技術(shù)，我可以請(qǐng)教你一下嗎？酶切之后連接完了不可以直接PCR驗(yàn)證嗎？為什么還要做轉(zhuǎn)化呢？是不是因?yàn)檫B接后的反應(yīng)液太少，然后轉(zhuǎn)化擴(kuò)繁要增大量呢？ 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
5樓2016-10-22 21:59:59
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