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494750284木蟲 (小有名氣)
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[求助]
酶切所得片段與預(yù)期不符
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我的插入基因大小為970+，由PCR獲得。引物兩端酶切位點(diǎn)分別為EcoR I和 BamH I，插入片段內(nèi)部不含上述酶切位點(diǎn)。 因?yàn)镻CR效率比較低，所以以第一次PCR產(chǎn)物稀釋100倍作為模板進(jìn)行了第二次PCR，切膠回收后跑電泳驗(yàn)證，除了濃度降低，大小沒變。 接下來，我將970+目的基因插入到pEASY-T1 simple vector, 藍(lán)白斑篩選白色菌落，小提質(zhì)粒，雙酶切，切下來的目的基因卻只有300多。各位蟲友幫忙分析分析，太奇怪了！    |
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gyesang
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【答案】應(yīng)助回帖
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小丹木木: 金幣+5, MolEPI+1, 積極應(yīng)助，熱心交流 2012-12-05 17:23:20
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不知樓主你挑取了幾個(gè)白色菌落，小提質(zhì)粒的？ 1. 如果樓主挑了很多的話，抽出來的質(zhì)粒雙酶切，目的片段都只有300多的話，那可能就是PCR切膠回收的問題了，是不是回收錯(cuò)了條帶，因?yàn)楦鶕?jù)樓主描述，似乎條帶大小在PCR時(shí)是對的。 2. 如果只挑了一個(gè)或者兩個(gè)白色菌落做質(zhì)粒抽提雙酶切，然后得到300多的條帶，不能說明剩下的所有白色菌落都是陰性克隆，這時(shí)樓主可以做個(gè)菌落PCR篩選試試 3. 還有樓主確信兩次PCR擴(kuò)出來的條帶大小都是符合預(yù)期的，按你的描述，說兩次PCR，濃度都很低，感覺產(chǎn)物像是非特異性的產(chǎn)物，假如這非特異性條帶中間有EcoRI或者BamHI的話，就正好把條帶給切了到300bp 個(gè)人意見，僅供參考！ |
2樓2012-12-05 15:39:09
seanzhu1996
木蟲 (著名寫手)
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【答案】應(yīng)助回帖
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| 檢查pEASY-T1 simple vector中是否有EcoR I和 BamH I兩個(gè)位點(diǎn)。根據(jù)你的描述，你的PCR產(chǎn)物的回收濃度較低，而且還是以第一次PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行的擴(kuò)增，有可能引入差異，導(dǎo)致位點(diǎn)變化，建議找好條件以后用原始模板重做PCR，然后再做克隆。 |
3樓2012-12-05 15:40:40
494750284
木蟲 (小有名氣)
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打了這么多字，真實(shí)辛苦了，謝謝。 我的片段問題，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增效率比較低。第一次PCR得出目的條帶，位置正確，亮度較低。第二次PCR得出三條帶：目的條帶位置正確，另外兩條非特異性擴(kuò)增。我確定回收條帶肯定是沒錯(cuò)的。 第二個(gè)問題，我那個(gè)轉(zhuǎn)化只出來了零星幾個(gè)菌落，4個(gè)藍(lán)色的，兩三個(gè)白色的。挑了兩個(gè)白色的。針對這個(gè)，我重新買了Takara的T載體，打算明天重新做一次。 第三個(gè)問題：我將得到的質(zhì)粒送去測了一下序，306個(gè)bp與NCBI完全吻合。應(yīng)該分析一下，這個(gè)吻合片段有什么特點(diǎn)。 唉，構(gòu)建載體原理簡單，咋就這么麻煩呢。。。。。 |
4樓2012-12-05 21:40:28
494750284
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5樓2012-12-05 21:43:04
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