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小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 分子生物 » 綜合其他 » 酶切所得片段與預期不符
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494750284木蟲 (小有名氣)
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酶切所得片段與預期不符
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我的插入基因大小為970+，由PCR獲得。引物兩端酶切位點分別為EcoR I和 BamH I，插入片段內(nèi)部不含上述酶切位點。 因為PCR效率比較低，所以以第一次PCR產(chǎn)物稀釋100倍作為模板進行了第二次PCR，切膠回收后跑電泳驗證，除了濃度降低，大小沒變。 接下來，我將970+目的基因插入到pEASY-T1 simple vector, 藍白斑篩選白色菌落，小提質(zhì)粒，雙酶切，切下來的目的基因卻只有300多。各位蟲友幫忙分析分析，太奇怪了！    |
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494750284
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4樓2012-12-05 21:40:28
gyesang
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不知樓主你挑取了幾個白色菌落，小提質(zhì)粒的？ 1. 如果樓主挑了很多的話，抽出來的質(zhì)粒雙酶切，目的片段都只有300多的話，那可能就是PCR切膠回收的問題了，是不是回收錯了條帶，因為根據(jù)樓主描述，似乎條帶大小在PCR時是對的。 2. 如果只挑了一個或者兩個白色菌落做質(zhì)粒抽提雙酶切，然后得到300多的條帶，不能說明剩下的所有白色菌落都是陰性克隆，這時樓主可以做個菌落PCR篩選試試 3. 還有樓主確信兩次PCR擴出來的條帶大小都是符合預期的，按你的描述，說兩次PCR，濃度都很低，感覺產(chǎn)物像是非特異性的產(chǎn)物，假如這非特異性條帶中間有EcoRI或者BamHI的話，就正好把條帶給切了到300bp 個人意見，僅供參考！ |
2樓2012-12-05 15:39:09
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3樓2012-12-05 15:40:40
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5樓2012-12-05 21:43:04
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